Mae clefydau genetig yn dal i fod yn her fyd-eang, gan eu bod yn cael eu hachosi gan fwtaniadau mewn genynnau sy'n effeithio ar swyddogaethau biolegol, prosesau metabolaidd, neu gynhyrchu proteinau hanfodol penodol unigolion, i anhwylderau etifeddol amrywiol. Mae cyffuriau therapi genynnau yn fath o ymyriad therapiwtig sy'n targedu genynnau penodol, gan anelu at eu hatgyweirio neu eu haddasu, a darparu cyfarwyddiadau newydd i gelloedd gynhyrchu proteinau swyddogaethol neu ymyrryd yn y diffygion genynnau sy'n achosi clefydau.
Mae'r cyffuriau genynnol cyffredin yn bennaf yn cynnwys DNA ac RNA, lle gall DNA fod yn ddarnau genyn neu ddilyniannau genynnau gydag effeithiau therapiwtig. Mae'r DNA hyn yn cael ei ddosbarthu i gelloedd i ddisodli neu ychwanegu at y swyddogaethau genynnau diffygiol neu goll. Gall RNA fod yn RNA negesydd (mRNA), RNA ymyrryd bach (siRNA), neu oligonucleotides antisense (ASO), ac ati, y gellir eu defnyddio i addasu, atal mynegiant genynnau niweidiol, neu adfer swyddogaeth genynnau penodol.
Fodd bynnag, mae DNA ac RNA yn wynebu llawer o heriau o fynd i mewn i'r corff dynol i gyrraedd y celloedd targed. Gan fod dilyniannau genynnau yn ansefydlog yn y llwybr gastroberfeddol, fe'u gweinyddir fel arfer gan chwistrelliad mewnwythiennol neu isgroenol, ond er hynny, mae'r rhan fwyaf o'r dilyniannau genynnau yn dal i gael eu diraddio gan y cnewyllyn helaeth yn y corff dynol.
Pan fydd ychydig bach o gyffuriau genynnau gweddilliol yn cyrraedd y tu allan i'r celloedd targed, ni allant fynd i mewn i'r celloedd oherwydd bod dilyniannau genynnau yn foleciwlau mawr gyda grwpiau ffosffad yn cario taliadau negyddol, tra bod cellbilenni hefyd yn cario taliadau negyddol. Pan fydd dau wefr negyddol yn cwrdd, mae genynnau'n cael eu gwrthyrru ac ni allant fynd i mewn i'r celloedd. Felly, mae angen inni ddatblygu dulliau cyflenwi cyffuriau genynnau penodol i atal eu diraddio in vivo a gwella effeithlonrwydd treiddiad cellbilen, a chyflwyno dilyniannau DNA neu RNA i'r celloedd yn esmwyth.
Dulliau Cyflenwi ar gyfer Cyffuriau Genynnau
Mae'r dulliau cyflwyno genynnau cyffredin presennol wedi'u rhannu'n bennaf yn ddau gategori: danfon fector firaol a danfon fectorau nad ydynt yn feirysol. Mae cyflwyno fector firaol yn bennaf yn cynnwys firws cysylltiedig adeno (AAV) a lentivirus, ac ati, a all efelychu'r broses o heintio â firws y celloedd lletyol a chroesi rhwystrau celloedd yn hawdd, gan gyflawni effeithlonrwydd dosbarthu uchel. Fodd bynnag, mae gan gyflwyno fector firaol broblemau hefyd: yn gyntaf, mae ganddo gapasiti pecynnu cyfyngedig, fel cynhwysedd pecynnu uchaf AAV yw 4.7kb, na all gyflawni dilyniannau genynnau hirach; yn ail, gall fectorau firaol achosi adweithiau imiwn difrifol, gan gynnwys imiwnedd cellog ac imiwnedd humoral, gan beri risgiau ar gyfer cymwysiadau clinigol. O gymharu â hynny, mae gan fectorau anfeirysol fanteision enfawr o ran diogelwch a gallu llwytho cyffuriau.
Mae'r fectorau an{0}}feirysol presennol a ddefnyddir yn gyffredin yn bennaf yn cynnwys liposomau, polymerau, nanoronynnau, ecsosomau, ac ati, ac ymhlith y rhain mae liposomau yn fesiglau a ffurfiwyd gan foleciwlau amffiffilig â diamedrau yn amrywio o 100nm i 1um. Maent yn cynnwys ffosffolipidau, colesterol, lipidau PEG a lipidau cationig yn bennaf. Mae'r strwythur haen ddeuffosffolipid yn debyg i gellbilenni a gall fynd i mewn i gelloedd yn esmwyth trwy endocytosis. Yn ogystal, gall liposomau hefyd addasu PEG neu wrthgyrff penodol ar eu harwynebau i ddianc rhag cliriad imiwnedd y corff wrth dargedu meinweoedd neu gelloedd penodol. Mae liposomau cationig yn liposomau sy'n cynnwys lipidau halen amoniwm cwaternaidd â gwefr bositif, a all rwymo'n well â chyffuriau asid niwclëig â gwefr negyddol a chynnal sefydlogrwydd y system ddosbarthu. Felly, liposomau yw un o'r dulliau dosbarthu fector anfeirysol cyffredin ar gyfer cyffuriau genynnol.
Fodd bynnag, mae gan liposomau traddodiadol rai problemau hefyd: yn gyntaf oll, oherwydd y rhychwant mawr o ddiamedrau liposome, er y gall hyn sicrhau digon o gapasiti llwytho cyffuriau, pan fydd liposomau'n mynd trwy'r bwlch endothelaidd fasgwlaidd (100{{}}} 200nm), bydd maint rhy fawr yn rhwystro'r broses hon. Yn ogystal, ar ôl i liposomau fynd i mewn i gelloedd trwy endocytosis a ffurfio system endosome-lysosome, ni all liposomau traddodiadol gwblhau dianc lysosomaidd mewn pryd, gan arwain at y rhan fwyaf o gyffuriau genynnol yn cael eu diraddio gan lysosomau ac yn methu â chyflawni eu heffeithiau. Yn seiliedig ar y diffygion hyn o liposomau traddodiadol wrth ddosbarthu cyffuriau genynnau, mae nanoronynnau lipid (LNP) wedi'u datblygu ac maent wedi dod yn ddull cyflwyno pwysig sy'n arbennig o addas ar gyfer dosbarthu asidau niwclëig i gelloedd a meinweoedd targed.
Cyflwyniad i System Cludo LNP
Mae nanoronynnau lipid (LNP) yn nanoronynnau sy'n cynnwys sylweddau tebyg i lipid a diamedr yn gyffredinol rhwng 10-200nm. O'u cymharu â liposomau traddodiadol, maent yn llai ac yn haws eu pasio trwy fylchau endothelaidd fasgwlaidd. Yn ogystal, mae LNP fel arfer yn cynnwys lipidau cationig / ïonadwy, ffosffolipidau ategol, lipidau polyethylen glycol (PEG) a cholesterol. Yn eu plith, gall ffosffolipidau ategol a cholesterol gynyddu sefydlogrwydd LNP; Mae lipidau PEG yn helpu i gynyddu amser cylchrediad LNP in vivo a lleihau adweithiau imiwn. Mae gan y cydrannau hyn swyddogaethau tebyg i liposomau traddodiadol. Mae'r gwahaniaeth yn gorwedd yn y lipidau cationig / ionizable, sydd hefyd yn brif faes amddiffyn patent ar gyfer LNP.
Fel y soniwyd yn gynharach, gall liposomau cationig gynnal y rhwymiad â chyffuriau asid niwclëig yn effeithiol a gwella effeithlonrwydd cyflwyno cyffuriau asid niwclëig. Fodd bynnag, mae liposomau cationig hefyd yn dueddol o gael eu rhwymo heb fod yn benodol â phroteinau plasma â gwefr negyddol, celloedd gwaed, ac ati yng nghylchrediad y corff, gan achosi agregu liposomau a chael eu clirio'n gyflym o'r corff (dim ond 15 munud yw hanner oes liposomau cationig in vivo).
I ddatrys y broblem hon, mae ymchwilwyr wedi datblygu math newydd o ddeunydd lipid o'r enw lipidau ionizable. Mae lipidau ïonadwy yn debyg iawn i lipidau cationig o ran strwythur. Gan gymryd y lipid cationig cyffredin DOTAP a DODAP lipid ionizable fel enghreifftiau, y gwahaniaeth yw bod DOTAP yn halen amoniwm cwaternaidd gyda gwefr bositif, tra bod DODAP yn strwythur amin trydyddol. Gall y strwythur amin trydyddol gadw pKa'r lipid rhwng 6-7. Pan fo pH yn is na pKa (o dan amodau asidig), codir tâl positif am lipidau ïonadwy.
Pan fo pH yn agos at pKa (o dan amodau niwtral), mae lipidau ïonadwy yn niwtral. Gall y dyluniad hwn ddatrys y broblem a wynebir gan liposomau cationig yn glyfar: gan fod y pH mewn cylchrediad gwaed yn agos at niwtral, mae lipidau ïonadwy hefyd yn niwtral, ac mae'r rhwymiad nad yw'n benodol rhyngddynt a phroteinau plasma neu gelloedd gwaed yn cael ei leihau'n sylweddol, gan ymestyn yr hanner bywyd. Yn ogystal, pan fydd celloedd yn cymryd LNP lipid ïonadwy ac yn mynd i mewn i lysosomau, mae'r lipidau'n cael eu hïoneiddio a'u gwefru'n bositif yn yr amgylchedd lysosomaidd â pH 5-6. Mae'r lipidau â gwefr bositif yn cael eu hasio'n hawdd â'r bilen endosome-lysosom, gan ganiatáu i'r liposomau ddianc i'r cytoplasm, daduno a rhyddhau asidau niwclëig, gan roi eu heffeithiau ar waith. I grynhoi, mae dylunio system cludo LNP yn golygu optimeiddio cyfansoddiad lipid, maint gronynnau, tâl arwyneb a sefydlogrwydd i gyflawni cyflenwad genynnau effeithlon.
Strategaeth Bio-ddadansoddi LCMS ar gyfer Cyffuriau Genynnau wedi'u Pecynnu gan LNP
Mae cyffuriau genynnau wedi'u pecynnu gan LNP yn cynnwys cyffur cragen a genyn LNP ei hun yn bennaf. Mae'r gragen LNP yn cynnwys cydrannau lipid yn bennaf (mae lipidau cationig / ionizadwy yn cyfrif am tua 30-50%, mae lipidau PEG yn cyfrif am tua 2%, mae colesterol yn cyfrif am tua 20-50%, mae ffosffolipidau ategol yn cyfrif am tua 10-20%), tra bod cyffuriau genynnol yn bennaf yn cynnwys darnau dilyniant genynnau (DNA, ASO, siRNA, ac ati). Yn ôl rheoliadau diweddaraf NMPA a FDA[14-15], ar gyfer cymhwyso IND o gyffuriau system cyflenwi cyffuriau fel LNP, yn ogystal â chynnal astudiaethau ffarmacolegol a ffarmacocinetig ar y cynhwysyn gweithredol (dilyniant genyn), mae angen gwerthusiad diogelwch a fferyllol hefyd ar gyfer cydrannau lipid newydd nad ydynt wedi'u defnyddio mewn cyffuriau wedi'u marchnata yn y system cyflenwi cyffuriau, megis lipidau cationig/ionizadwy mewn lipidau cationig/ionizadwy a lipidau PEG arbennig.
Mae bio-ddadansoddiad LCMS o lipidau LNP yn canolbwyntio ar lipidau cationig/ionizadwy a lipidau PEG. Oherwydd y gwahaniaethau strwythurol rhyngddynt, mae pwysau moleciwlaidd lipid cationig / ionizable yn gyffredinol o fewn 1 kDa, tra gall pwysau moleciwlaidd lipid PEG gyrraedd 2 ~ 5 kDa ar ôl cynnal grwpiau addasu, gan arwain at wahaniaethau mawr mewn cadw cromatograffig ac ymateb sbectrometreg màs rhyngddynt. O ystyried bod cynnwys lipid cationig / ionizadwy mewn LNP yn uwch na lipid PEG, mae'r gwahaniaeth ymateb yn arwain at anallu i uno'r dulliau rhag-drin (dethol hydoddydd echdynnu, pennu ffactor gwanhau) y ddau yn effeithiol. Yn ogystal, oherwydd presenoldeb llawer o gopaon ymyrryd o amgylch safle brig lipid PEG, mae angen graddiant gwahanu cyfnod hylif hirach yn aml ar gyfer gwahaniad effeithiol, na all warantu effeithlonrwydd dadansoddi uchel. Felly, rydym yn sefydlu dull canfod lipid PEG ar wahân mewn bio-ddadansoddiad. Ar yr un pryd, mae lipid cationig / ionizable a lipid PEG hefyd yn cael anawsterau cyffredin wrth ddatblygu dull oherwydd eu cydrannau lipid, megis hydoddedd gwael mewn dŵr, ansefydlogrwydd mewn matrics biolegol, rhwymiad protein i adferiad sy'n fwy na'r terfyn, ymyrraeth uchel a gweddillion lipid PEG, newid sefydlogrwydd lipid mewn matrics sampl go iawn ac anhawster wrth ddewis safon fewnol.
